染色体原位分子杂交手艺

染色体原位分子杂交手艺

染色体原位分子杂交手艺（Chromosome Analysis by Fluorescence in situ Hybridization，，，，，，FISH）的生长为研究染色体DNA序列提供了直观而有用的要领。。。。该手艺具有经济、清静、操作快速、稳固性好及迅速度高等优点。。。。多色FISH可在统一细胞核内同时显示两种或多种序列，，，，，，并可用于间期细胞核染色体的研究。。。。通过使用差别类型的探针，，，，，，可显示某一物种的所有基因组、特定染色体片断以及单拷贝序列。。。。连系共聚焦激鲜明微镜，，，，，，还可对间期细胞核及染色体举行三维结构剖析，，，，，，从而实现杂交信号的准确检测与定位。。。。

二、探针（probes）

1．基因组探针（Genomic probe）：

人类基因组中含有大宗高频重复序列，，，，，，其进化守旧性较低。。。。当以基因组DNA作为探针时，，，，，，探针与靶细胞序列中高度重复序列会优先退火连系，，，，，，从而避开守旧的单拷贝序列，，，，，，因此杂交泛起显着的种属特异性。。。。使用该类探针在人—鼠杂交细胞中可特异性显示人类遗传物质。。。。

2．染色体特异性序列探针（Probe recognizing chromosome specific sequences)：

现在在人类险些所有染色体中均已克隆到特异性重复序列，，，，，，其重复次数约为100～5000次，，，，，，多位于着丝粒区或异染色质区，，，，，，形成致密的杂交带，，，，，，可用于特异识别某一条染色体

3．染色体文库探针（chromosome labraries probe）：

染色体文库网络人类单条染色体的DNA作为探针，，，，，，又称整体染色体探针或染色体染探针。。。。单条染色体的获得一样平常有两种要领：来自仅携有某一条人类染色体的体细胞杂交株，，，，，，或经流式细胞分类仪从染色体悬液中疏散

4．简单序列探针（single-copy sequences probe）：

FISH有一弱点，，，，，，就是要求探针足够大，，，，，，探针越小，，，，，，杂交位点检出率就越低。。。。欲使用FISH检测保存基因组内的简单序列基因，，，，，，最有用的要领是应用含大插入片断的克隆载体，，，，，，如全Cosmids（载约40kb的插入片断），，，，，，更大的YAC载体（载100-800kb插入片断）。。。。若掌握好，，，，，，小到2kb的质粒探针亦可用FISH要领定位，，，，，，但效率较低。。。。

三、FISH手艺系列

1．24色 mFISH核型剖析手艺

24色mFISH是近年建设的核型剖析手艺。。。。其原理是使用5种荧光染料按比例标记探针，，，，，，杂交后形成24条染色体各自泛起特异的荧光色彩以供核型剖析。。。。为研究职员提供了更富厚详尽的细胞遗传学信息，，，，，，包括确定标记染色体的泉源、检测细小的染色体易位和检测重大的染色体易位，，，，，，尤其为肿瘤细胞染色体剖析提供了全新、高效的要领。。。。

2．原位杂交显带手艺(In situ hybridization banding,ISHB)

为了准确定位原位杂交部位所处染色体及其区带，，，，，，染色体必需显带。。。。但无论是先杂交后显带，，，，，，照旧显带后杂交，，，，，，杂交与显带历程回相互影响效果。。。。厥后人们注重到，，，，，，人类短距离插入重复序列中的一种Alu家族，，，，，，Alu片断约300bp长，，，，，，在基因组中重复约九十万次，，，，，，平均距离3-4kb就插入一个。。。。有人使用部分Alu序列作为引物，，，，，，用PCR要领扩增Alu之间的DNA，，，，，，称Alu-PCR法。。。。但Alu序列在基因组内漫衍不是随机的，，，，，，有些区域较量麋集，，，，，，有些区域较希罕。。。。只有前者才有PCR产品。。。。人们用Alu-PCR产品作为探针与人类染色体标本杂交，，，，，，效果获得类似R带的荧光带型。。。。故人们在举行基因定位时，，，，，，只需将目的探针与Alu-PCR探针同时应用，，，，，，用差别颜色的荧光标记，，，，，，就可同时显示杂交信号和染色体带型。。。。

3．FISH基因定位（FISH mapping）

基因定位时，，，，，，不但需要确定某段靶序列在染色体上的位置，，，，，，尚需确定两个或两个以上靶序列在线性DNA分子的排列序次和距离，，，，，，才华绘出基因图。。。。一样平常用同位素杂交：先确定每一靶序列在中期染色体上的位置，，，，，，然后凭证它们到端粒的距离确定出线形排列序次。。。。而用FISH要领，，，，，，两种或两种以上的探针能同时与中期染色体杂交，，，，，，只要凭证两种颜色杂交位点的相互位置，，，，，，就能直接确定序次。。。。但中期染色体是线形DNA分子经由折叠和包装后形成的，，，，，，若两个靶序列相距很近，，，，，，例如间距小于1Mbp，，，，，，受包装历程的影响，，，，，，它们在线形DNA分子上的排列与在中期染色体上的排列纷歧定相同，，，，，，甚至可能完全相反。。。。学者们发明，，，，，，靶序列之间在间期核的平均相对距离与它们在线形DNA分子上的距离呈正相关。。。。使用间期核FISH剖析不但能扫除染色体包装的影响，，，，，，还能提高测距的区分率。。。。

四、FISH的应用

1．基因定位与基因制图（Gene mapping）

原理前面已叙述。。。。FISH已经极大地加速了人类基因定位和基因制图的历程。。。。

2．基因诊断(Gene diagnosis)

准确、直观、明晰

3．间期细胞遗传学（Interphase cytogenetics）

4．FISH在肿瘤生物学中的应用

（1）肿瘤细胞遗传学（Onco-cytogenetics）

（2）基因定位：FISH可用于疏散出的癌基因与抑癌基因起源定位

（3）病毒基因插入基因组部分的检测：

虽然逆转录病毒以激活原癌基由于主，，，，，，也有象腺病毒、HPV、SV40等病毒以卵白产品与抑癌基因卵白产品相互作用而诱导细胞转化。。。。但病毒基因特殊是DNA病毒多有病毒基因因素插入到人基因组。。。。使用FISH可以检测到病毒整合到人基因组中的情形，，，，，，对深入研究病毒致癌机理，，，，，，以及检测、防治均具有主要意义。。。。

（4）基因的扩增与缺失

原癌基因的激活与抑癌基因的失活是现在肿瘤研究的热门。。。。

已知原癌基因的激活方法有：突变、基因扩增、易位、病毒序列插入。。。。

抑癌基因的激活方法有：点突变、基因缺失。。。。

FISH为研究基因的扩增和缺失提供了新的要领，，，，，，能将基因扩增和染色体重复脱离。。。。