原位杂交手艺的基本流程有哪些？？？？

原位杂交（In Situ Hybridization，，，ISH）是使用特异性标记的已知碱基序列核酸作为探针，，，凭证碱基互补配对原则，，，在组织或细胞原位与待检测核酸爆发特异性连系形成杂交体，，，并通过与标记物相对应的检测系统举行显色，，，从而在细胞内对目的核酸举行定位的手艺。。。。。

原位杂交按标本类型可分为组织切片原位杂交和细胞原位杂交；
；按探针与靶核酸的类型可分为DNA-DNA、RNA-DNA 和 RNA-RNA 杂交；
；按标记方法可分为放射性探针法与非放射性探针法。。。。。其基本流程包括牢靠、切片（或制片）、杂交和显色等办法。。。。。

(一)取材与标本牢靠

1． 取材

关于原位杂交所用的质料要尽可能新鲜，，，为了避免RNA的降解，，，取材要迅速，，，取材后要尽快牢靠或冷冻生涯。。。。。

2．牢靠

组织或细胞在举行原位杂交前必需牢靠，，，其目的为了：

（1）坚持细胞形态原有结构；
；
（2）最大限度生涯细胞内的DNA或RNA的水平；
；
（3）使探针易于进入细胞或组织内。。。。。

3．牢靠液

常用牢靠液包括10％甲醛、4％多聚甲醛、冰醋酸-酒精混淆液、Bouin氏牢靠液等。。。。。种种牢靠液各有优弱点，，，应凭证实验工具选择合适的牢靠液。。。。。

4．牢靠要领

组织标本取材后，，，迅速放入牢靠液中2～4h，，，取材组织巨细为1cm×1cm×0.5cm，，，不宜太大。。。。。须要时，，，动物组织可举行灌流牢靠，，，然后将组织按要求取材放入20%蔗糖中，，，4℃住宿，，，越日可以举行冰冻切片。。。。。

(二)切片及细胞标本的制备

1．载玻片的处置惩罚

原位杂交通常在载玻片上举行，，，载玻片必需清洁且无核酸酶污染。。。。。一样平常载玻片可先经洗衣粉浸泡住宿，，，用流水冲洗、酸中浸泡4～8h，，，再用流水冲洗，，，双蒸水洗2～3次。。。。。在160℃烤箱中烘烤2～4h。。。。。亦可经15磅高压灭菌20min处置惩罚，，，可将载玻片上的核酸酶消除。。。。。

2． 组织切片与预处置惩罚

（1）冰冻切片：新鲜组织也可在取材后，，，直接置入液氮中迅速骤冷，，，冷冻切片后，，，4％多聚甲醛牢靠5～10min，，，也可生涯在-70℃中待用。。。。。杂交前切片迅速恢复至室温并干燥，，，0.1mol PBS洗三次，，，2×SSC洗10min，，，滴加预杂交液室温孵育1h。。。。。

（2）石蜡切片：组织牢靠后，，，通例石蜡包埋切片，，，可恒久生涯，，，随时用于原位杂交。。。。。杂交前切片经：

二甲苯脱蜡2次，，，每次10min；
；
纯酒精洗2次，，，每次5min；
；
空气干燥5min；
；梯度酒精复洗95％，，，80％，，，70％各1min；
；
0.1 mol PBS洗3次，，，每次5min；
；
2×SSC洗10min；
；
滴加预杂交液于湿盒内室温孵育1h。。。。。

（3）作育细胞：每张载玻片滴加200μl、浓度为1×10⁵/ml的细胞悬浮液，，，空气干燥1～2min制成细胞涂片，，，也可直接用作育细胞盖片。。。。。上述细胞片经酒精或多聚甲醛牢靠5min，，，其余办法同冰冻切片。。。。。

(三)试剂配制

配制溶液历程中均需戴手套，，，液体配制均用超清水，，，所用瓶子均经160℃烘烤4h，，，主要目的是去除RNA酶。。。。。

1． DEPC水　将DEPC按1‰浓度加入超清水中，，，充分混淆后静置住宿，，，15~20min高压消毒，，，之后室温避尘存放。。。。。

2． 0.1mol PBS　pH 7.4

A液：0.1mol NaH2PO4为NaH2PO4 (MW：156.01，，，2H2O) 1.56g；
；DEPC水 100.00ml。。。。。
B液：0.1mol Na2HP04为Na2HPO4 (MW：358.14，，，12H2O) 17.907g；
；DEPC水 500.00ml。。。。。
A液：B液＝9.5∶40.5 加NaCl使其浓度达0.85％。。。。。

3． 20×SSC　为NaCl(3mol/L) 8.765g；
；Na3C6H50H2O7·2(0.3mol/L) 4.410g；
；DEPC水50.00ml。。。。。

4． 4％多聚甲醛(pH 7.4)　为多聚甲醛4g；
；0.1mol PBS 100ml。。。。。

5． 缓冲液

（1） 缓冲液Ⅰ(pH 7.5)　为1mol Tris-HCl 100ml；
；5mol NaCl 20ml；
；消毒超清水加至1000ml。。。。。
（2） 缓冲液Ⅱ(pH 9.5)　为1mol Tris-HCl 100ml；
；5mol NaCl 20ml；
；1molMgCI 50ml；
；消毒超清水加至1000ml。。。。。
（3） 缓冲液 Ⅲ(pH 9.5)　为1mol Tris-HCl 100ml；
；1molEDTA 5ml；
；5mol NaCl 20ml；
；1molMgCI 50ml；
；消毒超清水加至1000ml。。。。。

6． 去离子甲酰胺　将阴阳离子交流树脂各5g加入50ml甲酰胺中，，，待树脂下沉后用上清液。。。。。

7． 50％硫酸葡聚糖　5g硫酸葡聚糖加10ml DEPC水，，，一直搅动使之完全消融。。。。。

8． 50×Denhardt's液　为1％Ficoll type 400（聚蔗糖） 0.2g；
；1％PVP（聚乙烯砒硌烷酮）0.2g；
；1％BSA（牛血清白卵白）0.2g；
；DEPC水 20.0ml。。。。。

9． 预杂交液　为去离子甲酰胺5.0ml；
；20×SSC 2.0ml；
；鲑鱼精DNA (10mg/ml) ；
；0.5ml（滚水变性10min）；
；酵母tRNA (10mg/m1) 0.25ml；
；50％硫酸葡聚糖 2.00ml；
；50×Denhardt's液 0.20ml。。。。。

(四)杂交与显色

1．杂交

将已标记的探针加入预杂交液即成为杂交液（探针浓度为1μg/m1），，，切片经2×SSC短暂浸洗后，，，滴加杂交液，，，于湿盒内置37℃或42℃孵育住宿。。。。。然后依次经2×SSC室温浸洗1h，，，l×SSC室温浸洗1h，，，0.5×SSC 37℃浸洗30min，，，0.5×SSC室温浸洗30min。。。。。注重滴加杂交液时切片勿干燥。。。。。

2． 显色

以下各步均在室温下举行。。。。。

（1）缓冲液I洗1min。。。。。
（2）用含2%正常羊血清和0.3％TritonX-100的缓冲液I孵育切片30min。。。。。
（3）用含1％正常羊血清和0.3％TronX-100的缓冲液I稀释羊抗DIG抗体。。。。。
（4）将抗体稀释液滴加在切片上，，，封口膜笼罩，，，湿盒内4℃孵育住宿。。。。。
（5）缓冲液I洗10min。。。。。
（6）缓冲液Ⅱ洗10min。。。。。
（7）加显色液，，，封口膜笼罩，，，避光室温孵育2～20h，，，随时镜检，，，当显色知足时入缓冲液Ⅲ终止显色。。。。。显色液临用前配，，，其配方为：①NBT 45μl；
；②X-Phospllate液 35μl；
；③左旋咪唑 2.4mg；
；④缓冲液Ⅱ 加至10ml。。。。。
（8）通例脱水、透明、封固。。。。。

效果：杂交阳性信号为紫蓝色颗粒。。。。。

(五)原位杂交比照试验

同免疫组织化学染色比照一样，，，为证实原位杂交实验操作的准确性和实验效果的特异性，，，需要设置一系列比照实验，，，详细的种种比照实验的设置及其意义请参考原位杂交专著，，，以下仅先容几种常用的比照实验。。。。。

1．省去标记探针　在做原位杂交时，，，以PBS或预杂交液替换杂交液，，，效果应为阴性，，，这是一种轻盈而有意义的阴性比照实验。。。。。如省去标记探针仍泛起阳性反应，，，这一定是假阳性。。。。。

2．自身比照　用统一组织切片或涂片上与靶序列无关的其他结构作比照。。。。。阳性与阴性结构同在一个视野中，，，相互印证，，，这自己就是对阳性反应的特异性比照。。。。。

3．阴性比照　用已知不保存响应靶序列的组织标本杂交，，，效果应为阴性。。。。。阴性比照可扫除在杂交历程中由于非特异性杂交反应等因素造成的假阳性效果。。。。。

4．阳性比照　用已知含靶序列的组织切片与待检标本同样处置惩罚，，，效果应为阳性，，，称阳性比照。。。。。通过阳性比照可证实杂交历程中各个办法以及所使用的试剂都合乎标准，，，实验要领可靠。。。。。尤其当待检标本为阴性时，，，阳性比照片呈阳性反应可扫除待检标本假阴性的可能。。。。。故若预期杂交效果为阴性时，，，就必需设阳性比照，，，当阳性比照亦不显色，，，就证实杂交历程的某一办法或所用试剂问题。。。。。