新药发明阶段高通量ADME研究

在最近的十几年内，，，，，，药物发明和开发的周期越来越长、本钱越来越高。。药物发明和开发的周期越来越长、本钱越来越高。。在西方国家，，，，，，开发并上市一个新化合物实体需要10～15年时间，，，，，，破费凌驾8亿美元。。每10000个新化合物实体中，，，，，，约有10个能进入临床研究阶段，，，，，，但最终只有一个能够获批上市。。纵然已上市的药物，，，，，，也可能因泛起不可接受的不良反应而撤市。。因此，，，，，，新药研发是一个"高危害、低效率"的历程。。立异药物的研发历程通常由3个阶段、4个办法组成：

为了推动更多药物乐成上市，，，，，，通？？？？？梢越幽闪街植椒ィ阂皇窃鎏砩秆』衔锏氖，，，，，，但这一方法受到经费、时间、资源和研发规模等条件的限制；；；二是提高新药研发的乐成率，，，，，，例如接纳合理的药物设计战略，，，，，，以及在药物发明阶段提前开展ADMET研究等。。相比之下，，，，，，提高研发乐成率更受到研发机构和制药企业的重视。。

1990年的一项回首性研究发明，，，，，，临床阶段失败的候选药物中，，，，，，约40％是由于药代动力学方面的问题所导致。。制药行业逐渐熟悉到，，，，，，纵然候选药物具有优异的靶点活性和选择性，，，，，，若是其ADME特征无法知足类药性要求，，，，，，最终仍难以开发成为真正的药物。。因此，，，，，，研究职员将原本处于药物发明后期的ADME研究提前至药物发明早期阶段，，，，，，以便尽早镌汰不切合类药性要求的化合物，，，，，，从而提高研发乐成率。。经由数十年的生长，，，，，，2000年的统计效果显示，，，，，，临床阶段失败药物中因PK问题导致镌汰的比例已显著下降。。

在药物发明阶段开展ADME研究时，，，，，，面临的主要问题包括：需要测试的化合物种类极为重大（这主要得益于组合化学清静行合成手艺的生长）、所涉及的实验项目繁多，，，，，，而单个化合物可供测试的样品量却十分有限。。因此，，，，，，需要对现有测试要领举行微量化、自动化和高通量刷新，，，，，，使化合物测试速率能够与组合化学的合成速率相匹配。。

别的，，，，，，在实验流程设计方面，，，，，，为了加速新药研发历程，，，，，，研究职员逐渐接纳平行（parallel）操作模式，，，，，，将相关研究同步开展。。古板上多接纳顺序（serial）研究模式，，，，，，即完成一项实验后再开展下一项实验，，，，，，这种方法效率较低。。未来的生长偏向是将虚拟化合物库筛选与平行操作相连系，，，，，，使用建设的构效关系，，，，，，在无需现实合成化合物的情形下，，，，，，对虚拟化合物库举行筛选，，，，，，从而大幅节约研发资源并加速药物发明速率。。

在药物研发历程中，，，，，，ADME研究主要包括三类要领：虚拟要领（in silico）或盘算要领（computational method）、体外要领（in vitro）以及体内要领（in vivo）。。这三类要领各有其优弱点。。

使用高通量筛选手艺可以快速判别先导化合物，，，，，，但通过组合化学构建的化合物库，，，，，，首先是保存结构多样性差的问题，，，，，，这降低了化合物开发的乐成率；；；其次是化合物的类药性差，，，，，，使大宗的化合物在ADME筛选时代被镌汰，，，，，，增添了实验本钱。。已往的20年，，，，，，虽然药物发明阶段的新手艺层出不穷，，，，，，但每年上市的新化合物实体却没有实质性增添。。另外，，，，，，现在所建设的高通量测定要领大都与所试验的化合物结构种别有关，，，，，，并不具有完全的通用性。。

一、虚拟筛选要领

只管现在已经开发出许多体内和体外微量化、轻盈化及自动化的实验要领，，，，，，并在剖析时间、劳动强度以及化合物处置惩罚数目等方面获得显著改善，，，，，，但实验要领仍保存耗时长、本钱高以及需要预先合成候选化合物等问题。。虚拟筛选要领可作为一种替换战略，，，，，，用于展望候选化合物的ADME特征，，，，，，且具有高通量或超高通量的优势。。

（一）小肠吸收展望

口服吸收与药物在胃肠道内容物中的消融度、解离度以及跨越胃肠道细胞膜的能力亲近相关。。因此，，，，，，化合物的理化性子是决议其小肠通透性的主要因素。。提高药物口服吸收的展望要领主要包括以下几种：

1. 基于Lipinski的五规则(role of five)要领。。

在化合物结构中，，，，，，将N和O原子视为氢键受体，，，，，，而将N—H、O—H基团视为氢键供体，，，，，，并通过软件盘算辛醇/水分派系数ClogP。。若一个化合物知足以下两项以上条件：

● 氢键供体数>5

● 氢键受体数目>10

● ClogP>5

● 分子量（MW）>500Da

则该化合物会被标记为保存开发危害，，，，，，其未来成药性可能保存问题。。该要领不适用于保存自动转运机制的口服药物吸收展望。。

2. 基于Lipinski“五规则”连系亲脂性与分子巨细的要领

该要领同样基于Lipinski“五规则”，，，，，，并连系化合物的亲脂性及分子巨细信息，，，，，，对化合物口服吸收历程中的被动扩散能力举行展望。。通过将化合物的内在亲脂性参数ClogD（思量心理pH条件下的解离情形）与反应分子巨细的参数——盘算分子折射率（calculated molecular refraction，，，，，，CMR）举行作图剖析，，，，，，可将化合物划分为4个象限。。

其中，，，，，，第1和第3象限中的化合物具有相宜的亲脂性，，，，，，能够较容易地举行跨膜转运；；；第2象限中的化合物分子较小且亲水性较强，，，，，，可通详尽胞间隙吸收；；；而第4象限中的化合物由于分子量较大且亲水性较强，，，，，，跨膜吸收较为难题。。因此，，，，，，可凭证化合物所在象限对其通透性举行展望。。

3. 基于分子极性外貌积（PSA）的要领

接纳分子极性外貌积（polar surface area，，，，，，PSA）作为药物吸收的展望指标。。研究批注，，，，，，PSA及分子量与通过Caco-2细胞模子获得的表观通透性参数之间具有优异的相关性。。

（二）血脑屏障(BBB)通透能力展望

在新药发明阶段，，，，，，关于作用于中枢神经系统的药物，，，，，，通常要求其具有一定的血脑屏障（BBB）透过能力；；；而关于作用于外周组织的药物，，，，，，则要求其BBB透过能力尽可能低，，，，，，以镌汰中枢神经系统不良反应。。因此，，，，，，需要对候选药物透过BBB的能力举行展望。。

Van de Waterbeemd提出了一种BBB通透性展望要领：当化合物的分子量（MW）< 450 Da、极性外貌积（PSA）< 90 ??时，，，，，，通常以为其具有较好的BBB透过能力。。但该要领未思量P-gp外排转运体的影响。。

（三）代谢稳固性的展望

为了获得最佳生物使用度，，，，，，药物不但需要具有优异的吸收特征，，，，，，还需要具备适当的代谢稳固性。。现在研究批注，，，，，，化合物的脂溶性、分子巨细与形状，，，，，，以及所含官能团的类型和位置，，，，，，均会影响药物在体内的稳固性。。其基础缘故原由在于化合物的结构是否能够进入P450酶的连系与催化位点。。

据报道，，，，，，现在虚拟筛选要领的展望准确率约为60%～90%，，，，，，且所接纳的履历模子与化合物训练集亲近相关。。未来仍需接纳更多结构多样化的化合物对模子举行验证，，，，，，同时进一步剖析体内ADME机制，，，，，，并建设基于机制的展望模子。。

二、体外要领

在已往十多年中，，，，，，体外要领已被普遍应用于药物通透性、生物使用度、代谢稳固性、药物相互作用以及药物理化性子等方面的研究与评价。。体外要领的优点主要体现在以下两个方面：一方面，，，，，，可通过微量化、自动化等手艺手段建设高通量或中等通量筛选模子；；；另一方面，，，，，，可使用泉源于人体的组织、细胞或相关生物组脱离展研究，，，，，，从而镌汰人类与动物之间的种属差别，，，，，，提高药物研发的乐成率。。

然而，，，，，，体外研究缺乏体内情形中的血流、生化因子及多种转运卵白等重大影响因素。。别的，，，，，，在化合物配制历程中使用的有机溶剂，，，，，，可能掩饰药物在体内的真实消融特征，，，，，，并影响药物代谢酶的活性。。

（一）小肠吸收的评价模子

药物经口服给药后，，，，，，需首先经由胃部的低pH情形，，，，，，随后进入十二指肠和小肠，，，，，，在溶出释放后通过小肠上皮细胞吸收入血循环。。小肠上皮细胞对药物的吸收主要包括4种方法：跨细胞转运、细胞间旁路转运、载体介导的摄取以及载体介导的外排。。

现在已开发出多种用于评价药物口服吸收的体外模子，，，，，，常见的包括Caco-2细胞模子、MDCK细胞模子以及PAMPA人工膜模子。。其中，，，，，，PAMPA模子主要用于评价药物通过被动扩散方法的吸收，，，，，，属于高通量研究要领；；；而Caco-2细胞模子和MDCK细胞模子则属于相对低通量的要领。。

（二）代谢稳固性研究

药物进入体内后，，，，，，作为外源性物质，，，，，，会履历由药物代谢酶介导的生物转化历程。。虽然某些保存于小肠上皮细胞中的P450同工酶（如CYP3A4）也可导致药物爆发首过效应，，，，，，但肝脏仍是体内最主要的代谢器官。。

肝脏中保存多种药物代谢酶，，，，，，包括Ⅰ相代谢酶，，，，，，如P450酶以及非P450酶类（如酯酶、黄素依赖性单加氧酶和单胺氧化酶等）；；；还包括Ⅱ相代谢酶，，，，，，如葡萄糖醛酸转移酶和磺基转移酶等。。其中，，，，，，P450酶是体内最主要的药物代谢酶系。。

在P450同工酶中，，，，，，CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1及CYP3A4等均与药物代谢亲近相关。。其中，，，，，，CYP3A4是P450酶系中含量最高、加入药物代谢比例最大的同工酶，，，，，，加入代谢的药物约占总代谢药物数目的50%。。

代谢稳固性是药物的主要性子之一。。关于代谢稳固性较差的药物，，，，，，通常需要频仍给药，，，，，，才华维持有用治疗浓度。。

由于药物代谢保存显着的种属差别，，，，，，因此在药物研发阶段，，，，，，接纳泉源于人体的组织或细胞举行研究，，，，，，其效果通常更靠近临床现真相形。。在酶代谢稳固性研究中，，，，，，常用的体外评价系统主要包括人肝微粒体和肝细胞。。研究批注，，，，，，人肝微粒体中P450酶的组成及比例与肝组织较为靠近，，，，，，且其易于生涯，，，，，，适用于高通量代谢稳固性研究；；；而肝细胞则含有完整的代谢酶系统，，，，，，无需特殊添加辅助因子，，，，，，但保存生涯时间较短、泉源受限等问题。。

（三）理化参数简直定

在药物发明阶段，，，，，，候选化合物的理化参数（如消融度、解离常数和亲脂性等）会影响药物的吸收、漫衍、代谢与渗透，，，，，，因此有须要在药物发明早期对这些参数举行系统测定。。现在，，，，，，已经开发出多种高通量理化参数测定要领。。

1. 消融度

经典的消融度测定要领为摇瓶法。。由于测定历程中需要抵达饱和状态，，，，，，因此实验周期较长（最长可达7天），，，，，，且样品消耗量较大，，，，，，不适用于高通量研究。。随后，，，，，，人们开发了多种高通量消融度测定要领，，，，，，其中在药物发明阶段较常用的包括比浊法和紫外吸收（UV）测定法。。这两种要领天天可测定命百个化合物的消融度。。

2. 亲脂性

亲脂性是指化合物或其部分基团对脂相情形的亲和能力，，，，，，通常以化合物在两相系统中的分派行为体现，，，，，，例如正辛醇/水分派系数。。亲脂性可用于展望药物的膜通透性及代谢稳固性。。

一样平常而言，，，，，，化合物的亲脂性越强（如logD > 5），，，，，，其膜通透性通常越高，，，，，，也越容易在体内被肝药酶代谢；；；而亲水性较强的化合物（如logD < 0），，，，，，则较难透详尽胞膜，，，，，，并更容易经肾脏渗透。。通常情形下，，，，，，理想药物的logD值多位于0～3之间，，，，，，从而在消融性与亲脂性之间抵达较好的平衡。。

常用的亲脂性测定要领包括摇瓶法，，，，，，其原理是将待测化合物消融于缓冲液中，，，，，，并加入一种与水不互溶的有机溶剂。。待系统抵达平衡后，，，，，，疏散两相，，，，，，并测定化合物在水相和有机相中的浓度。。在特定pH条件下测得的部分解离状态下的分派系数通常以logD体现；；；若测定系统中的化合物不爆发解离（如中性化合物），，，，，，则所得效果以logP体现。。

高通量亲脂性测定要领主要包括HPLC法，，，，，，通过测定化合物在流动相与非极性牢靠相（如C18键合相）之间的分派行为，，，，，，并以保存时间反应其亲脂性；；；别的，，，，，，还可接纳基于96孔板的紫外吸收测定要领。。

3. 解离度

化合物的解离度有助于相识其在差别pH条件下的解离状态。。当pH = pKa时，，，，，，化合物约有一半处于解离状态。。由于胃肠道及体内差别组织情形具有差别的pH值，，，，，，因此会影响药物的解离状态，，，，，，进而影响其消融度、亲脂性、吸收特征以及与卵白的连系能力。。

古板的pKa测定要领主要为电位滴定法，，，，，，但该要领通量较低、样品需求量较大，，，，，，天天通常只能测定约10个化合物。。另一种要领为毛细管电泳法，，，，，，其样品需求量较少，，，，，，但通量同样较低，，，，，，天天约可测定10个化合物。。

现在，，，，，，高通量测定要领主要接纳光谱梯度剖析法（spectral gradient analysis，，，，，，SGA）。。该要领可连系96孔板举行剖析，，，，，，天天的检测通量可抵达240个化合物。。

为了评估药物之间潜在的相互作用危害，，，，，，制药行业通常接纳以下要领开展相关实验。。

（四）药物相互作用研究

由于药代动力学相关的药物相互作用，，，，，，已有多种药物被撤市。。此类相互作用主要涉及两种机制：酶抑制和酶诱导。。

1. 代谢酶的判断

明确加入药物体内代谢的要害酶，，，，，，有助于评估待测药物与酶抑制剂或诱导剂之间的相互作用危害。。例如，，，，，，若是某种药物主要经CYP3A4代谢，，，，，，则其可能与CYP3A4抑制剂（如酮康唑、红霉素和伊曲康唑等）或诱导剂（如利福平和苯妥英等）爆发药物相互作用。。

在药物相互作用研究中，，，，，，可接纳肝微粒体、重组表达的代谢酶系统以及肝细胞等体外模子。。使用重组表达的代谢酶系统可判断加入药物代谢的详细酶种；；；通过将肝微粒体与特异性P450同工酶抑制剂联合使用，，，，，，也可推测相关代谢酶；；；而使用人肝细胞与抑制剂联合研究，，，，，，则有助于确定药物的代谢途径，，，，，，由于肝细胞不但含有Ⅰ相代谢酶，，，，，，还含有Ⅱ相代谢酶。。

2. 候选化合物对要害药物代谢酶抑制作用的评价

若某化合物能够抑制药物代谢酶，，，，，，则可能与该酶底物药物爆发药物相互作用。。研究中通常接纳肝微粒体连系特异性底物举行酶抑制实验，，，，，，并凭证测定获得的IC50或Ki值评估药物相互作用危害。。

别的，，，，，，也可使用重组表达的代谢酶系统或肝细胞开展相关研究。。该类研究通？？？？？山幽筛咄可秆》椒ň傩。。

3. 酶诱导潜力评价

若某药物能够诱导肝细胞中太过表达某种代谢酶，，，，，，则其可能与该代谢酶的底物药物爆发相互作用。。此类研究通常需要接纳活体原代肝细胞举行，，，，，，实验周期一样平常为2～4天，，，，，，因此属于低通量研究要领。。

另一种常用要领是接纳PXR-reporter细胞系举行研究，，，，，，以提高实验通量。。现在已知PXR（pregnane X receptor）是CYP3A4诱导剂的主要受体。。当药物与PXR连系后，，，，，，可激活相连的reporter基因，，，，，，从而提醒该药物可能为CYP3A4诱导剂。。

别的，，，，，，还需关注由药物转运卵白介导的药物相互作用。。同时，，，，，，应对酶抑制机制举行剖析，，，，，，以区分竞争性酶抑制和机制依赖性酶抑制。。据报道，，，，，，机制依赖性酶抑制更容易引发临床药物相互作用。。别的，，，，，，关于Ⅱ相代谢酶抑制作用的研究也应予以重视。。

三、体内要领

在药物发明阶段，，，，，，动物体内研究在给药剂量、采血时间点以及实验动物数目等方面，，，，，，与药物开发阶段的体内研究保存较大差别。。在这一阶段，，，，，，体内研究的主要目的在于优化先导化合物，，，，，，并连系体外研究效果，，，，，，为候选化合物的进一步开发提供依据和建议。。

体内研究通常具有通量低、耗时长、样品需求量大及研究本钱较高等特点，，，，，，但由于其具备体外研究所无法完全模拟的血流动力学、心理生化因子及整体机体情形等影响因素，，，，，，因此仍是新药研发历程中不可或缺的主要环节。。

为了提高体内研究的通量，，，，，，通常接纳两种战略：一是提高样品剖析速率，，，，，，二是镌汰样品收罗量。。

（一）提高样品剖析速率

在体内研究中，，，，，，通常需要测定大宗生物样品，，，，，，因此提高剖析速率是提升研究通量最常用的要领之一。。样品剖析要领主要包括HPLC和LC-MS/MS。。由于待剖析化合物的结构差别较大，，，，，，因此所建设的要领需要具备较高的迅速度和专属性。。

古板HPLC要领由于要领开发周期较长、样品前处置惩罚办法重大，，，，，，难以知足高通量剖析需求。。相比之下，，，，，，LC-MS/MS因具有迅速度高、专属性强以及样品处置惩罚轻盈（生物样品通常仅需举行卵白沉淀处置惩罚）等优点，，，，，，在样品剖析中的应用日益普遍。。但该要领仍保存基质效应滋扰的问题。。

另一种提高剖析速率的要领是接纳在线（online）固相萃。。╯olid phase extraction，，，，，，SPE）手艺，，，，，，实现样品处置惩罚自动化。。但该要领仍保存要领开发较为繁琐、整体剖析时间较长等缺乏。。

别的，，，，，，还可接纳湍流流动色谱（turbulent flow chromatography）手艺提高剖析通量。。该手艺可直接对血清、尿液等生物样品举行剖析，，，，，，而无需重大前处置惩罚。。其他提高剖析速率的要领还包括接纳MUX?系统举行并行LC-MS/MS剖析。。通？？？？？赏笔褂4根色谱柱，，，，，，并依次将各色谱柱流出液导入MS/MS离子源中。。与单根色谱柱的LC-MS/MS系统相比，，，，，，该要领的剖析速率可提高近4倍。。

在色谱柱选择方面，，，，，，为缩短剖析时间，，，，，，可接纳填料粒径更小的短色谱柱。。接纳此类色谱柱的液相色谱手艺通常称为快速疏散液相色谱。。例如，，，，，，使用细粒径短柱（2.1 mm × 20 mm，，，，，，填料粒径为3 μm或更。。⑼ㄓ每焖偬荻认赐烟跫（有机相在2 min内由5%升至95%，，，，，，流动相中含0.035%～0.05%三氟乙酸、0.1%甲酸或10 mmol/L乙酸铵）以及高流速（1～5 mL/min）等条件时，，，，，，可将单个样品的剖析时间缩短至约30 s。。

（二）镌汰样品数目

在体内研究中，，，，，，可接纳盒式给药（cassette dosing）的要领镌汰样品数目：将几种药物适用，，，，，，一次取样即可通过 LC-MS/MS 同时测定各药物的浓度。。该要领的主要争议在于可能保存药物相互作用。。

另一种要领是将数个含有差别药物的样品混淆后一同测定；；；别的，，，，，，也可将给药后差别时间点的血样等量混淆，，，，，，以简陋预计药物在体内的 AUC。。

需要强调的是，，，，，，应建设与测定速率相匹配的数据处置惩罚系统，，，，，，并使用响应软件将数据天生便于决议者阅读和剖析的报告。。