bDNA手艺在寡核苷酸及mRNA药物生物剖析中的应用与实例分享
随着手艺的一直前进 ，，生物医药蓬勃生长 ，，药物形式多变多样 ，，已经从古板的化药、抗体、卵白、多肽延伸到细胞、核酸等多种形式。。。。。新药物形态的一直涌现 ，，也对相关的生物剖析手艺提出了高要求和新挑战 ，，新型剖析手艺也一直被随之引入。。。。。yl23455永利新媒体的生物剖析系列专栏 ，，继续约请本事域的资深专业职员从差别的视角笔谈生物剖析 ，，本期将分享核酸类药物的别样剖析手艺：bDNA。。。。。
近年来 ，，核酸药物迎来了其快速生长的阶段。。。。。2016年至今 ，，共有 15 款核酸药物乐成在美国和/或欧盟获批上市 ，，包括 13 款寡核苷酸药物和2 款 mRNA 疫苗 ，，其中寡核苷酸药物中 8 款为反义核酸药物（ASO） ，，5 款为小滋扰核酸药物（siRNA）。。。。？？？？杉 ，，以ASO和siRNA为代表的寡核苷酸和mRNA成为了核酸类药物研发的热门细分领域 ，，海内外已有越来越多的寡核苷酸和mRNA进入到了IND或临床研究阶段。。。。。
核酸类药物除了涉及合成修饰、递送、稳固性及免疫原性等常见的要思量和战胜的问题外 ，，在进入IND和临床阶段也阻止不了药代动力学研究方面的挑战 ，，药代动力学的生物剖析要领就是其要面临的一个很现实的手艺性挑战。。。。。关于mRNA来说 ，，极易被核酸酶降解 ，，不稳固 ，，半衰期短 ，，要领需要高度迅速。。。。。虽然RT-qPCR迅速度很高且可以执行其定量剖析 ，，但涉及重大的核酸提取和反转录 ，，且核酸提取历程中会有损失、绝对提取接纳率不可控等问题 ；；；；；；关于寡核苷酸虽然可以通过修饰等手艺手段而使不稳固、半衰期短等情形得以有所改善 ，，但其自己分子量不大不小的特征（一样平常ASO为18-30nt的单链形式 ，，siRNA为20-25nt的双链形式） ，，无论是古板的小分子剖析手艺质谱照旧古板的核酸剖析手艺qPCR对其剖析都具有挑战性 ，，如质谱手艺涉及到残留保存、仪器污染及迅速度问题 ；；；；；；Stem-loop RT-qPCR的要领虽然可以委屈用于寡核苷酸 ，，但qPCR手艺自己着实越发适合于较长的核酸分子 ，，若是修饰的核酸分子则潜在更不适用。。。。。除了质谱和qPCR手艺外 ，，液相荧光检测手艺及Hybrid-ELISA（hELISA）手艺等都在核酸类药物剖析上有所应用。。。。。这几大类手艺形成的要领各有优势 ，，但也各有其劣势 ，，有的需消耗较高的样本量 ，，有的迅速度仍难以足够高 ，，有的涉及重大的反应办法或特殊酶的使用等等局限性。。。。。目今尚有一种核酸剖析手艺即bDNA(branch DNA)手艺 ，，可以在差别水平上填补上述各手艺的一些缺乏。。。。。bDNA手艺即支链DNA手艺 ，，该手艺综合了分子标记、探针设计、分子杂交、荧光或化学发光检测于一体的剖析手艺。。。。。该项手艺的实质是核酸分子杂交手艺的升级版 ，，同样需要特异性捕获探针和检测探针。。。。。
不过此手艺中的捕获探针和检测探针都带有特另外延伸序列 ，，捕获探针可以使用其延伸序列与Assay Plate上预包被的通用捕获序列互补连系 ；；；；；；检测探针为双“Z”型特殊结构 ，，其下端与目的分子特异性互补 ，， “Z”型探针上端的延伸部分可以与预放大探针连系 ，，然后由预放大探针、放大探针、标记探针逐步连系组成树枝状结构的探针组实现检测信号的级联放大 ，，从而抵达提高迅速度的效果【图1】。。。。。关于较短的小核酸 ，，检测探针的双“Z”型结构可以用非“Z”型的延伸探针无邪替换 ，，只要延伸序列可以与预放大探针互补连系即可。。。。。由于预放大探针、放大探针、标记探针都是牢靠的通用序列 ，，剖析所用的微孔板可预包被通用捕获探针 ，，因此这些试剂和耗材可以以试剂盒的形式被商业化提供。。。。。现在Thermo旗下的QuantiGene就围绕bDNA手艺提供了较为周全的配套牢靠组成的试剂盒产品 ，，其中已经包括了牢靠组成的信号放大系统和预包被通用捕获探针的Assay Plate及一些常用试剂 ，，大大便当了科研职员使用这项手艺。。。。。因此 ，，实践中只要针对详细的目的分子设计、筛选和定制好特异性的捕获探针与检测探针就可以实验使用bDNA手艺为自己的目的剖析物开发和优化要领。。。。。
该手艺战胜了古板的Real Time PCR手艺中的缺陷与不确定因素 ，，无需抽提纯化RNA ，，无需反转录 ，，无需PCR扩增 ，，只要将样本用特定裂解液裂解后 ，，经探针杂交与信号放大后即可迅速获得核酸定量效果 ，，每个反应微孔的终末状态样本用量才仅20-40微升即可。。。。。bDNA手艺在化妆品研发、生物医药及病毒检测等领域中均有应用 ，，此手艺在外洋医药研发领域应用较为普遍 ，，但现在海内医药研发领域现实应用甚少。。。。。由于其高迅速度且消耗样本量少的特点 ，，在临床前药代动力学和组织漫衍研究中 ，，尤其是关于那些特殊给药、特殊取材 ，，采样量有限的小动物试验有着奇异的应用优势。。。。。该项手艺可以普遍应用于ASO ，，siRNA等种种寡核苷酸以及mRNA的检测。。。。。Moderna公司就曾用此项手艺举行其mRNA产品的生物漫衍研究。。。。。yl23455永利生物手艺药物剖析部不但将该手艺乐成应用于mRNA产品的剖析 ，，并且也乐成将其应用到了ASO和siRNA两大最热门的寡核苷酸药物剖析中 ，，在海内率先实现了此手艺在核酸药物上的周全应用。。。。。此文将各连系详细现实案例对此手艺的应用举行简要先容。。。。。mRNA是一条单链核酸分子 ，，其长度和碱基数相关于ASO和siRNA要大许多。。。。。因此在使用bDNA实现mRNA剖析时 ，，其有着寡核苷酸不可与其相比的优势 ，，由于mRNA长度足够 ，，因此可以对一个mRNA设计多对双“Z”探针 ，，Z型探针越多则信号放大倍数更高 ，，迅速度就更易提高。。。。。
对一个mRNA分子 ，，与ASO和siRNA在该手艺使用上所思量的差别点是 ，，除了基于mRNA序列设计特异的捕获探针和双“Z”型探针外 ，，还需要设计一些与mRNA互补的关闭探针以防非特异性信号的爆发【图2】。。。。。
我们基于bDNA手艺可以很好地应用于mRNA剖析的原理 ，，对某mRNA分子使用bDNA手艺开发了其组织漫衍的剖析要领。。。。。如下例所示 ，，我们可以使用bDNA手艺不但将组织中mRNA的检测下限做到小于100copies/uL ，，并且其准确度和细密度都可以完全知足LBA手艺的规则所要求接受标准。。。。。从标准曲线上可以看出 ，，bDNA手艺要领中差别浓度标准品的仪器响应信号的倍增与浓度倍增间的关系趋近了理想的正比例关系【表1】 ，，因此可以做到使用一次方程线性拟合【图3】 ，，因其脱离了抗原-抗体反应关系的使用 ，，故其信号与浓度间的线性关系差别于LBA手艺及hybrid-ELISA手艺 ，，此后两者往往要用4参数或5参数的曲线举行拟合。。。。。表 1 bDNA检测某mRNA的标准曲线数据
图3 bDNA检测某mRNA标准曲线拟合
在一项Preclinical study中 ，，第一轮样品剖析中的仅少少部分的组织样品因需举行了重剖析 ，，而重复剖析的效果险些所有与首次剖析效果一致 ，，即90%以上的样品与首次剖析效果一致【图4】 ，，显示bDNA手艺要领具有优异的重现性。。。。。
3. bDNA在反义寡核苷酸（ASO）剖析上的应用
bDNA应用于ASO和siRNA时与在mRNA上的应用有所差别 ，，由于前两者是寡核苷酸 ，，链很短而不须要关闭探针 ，，且由于链短而也不利便使用双“Z”型探针 ，，也更不可能使用多个双“Z”型探针举行信号的放大 ，，一样平常情形下只能用非“Z”型的序列延伸探针 ，，例如【图5】所示。。。。。因此关于ASO的剖析 ，，其难度也相对大于mRNA。。。。。
yl23455永利实验室也将bDNA现实运用到了血浆中ASO的剖析 ，，也获得令人知足的迅速度拜见【表2】和【图6】。。。。。虽然其bDNA Assay开发和反应条件探索的历程要比mRNA艰辛重大。。。。。并且基于本实验室履历 ，，关于差别的ASO ，，其反应办法和反应系统需要无邪变换 ，，虽然现在可以买到含通用探针、Buffer和底物的试剂盒 ，，但不可被其完全局限。。。。。
为了顺应详细研究的ASO的特征尤其是为阻止稳固性和基质滋扰的影响 ，，我们需要针对性探索和替换一些特殊缓冲液或裂解液因素 ，，这些是通用试剂无法提供的。。。。。在迅速度的实现与提高上 ，，我们也基本上以为关于同样的一个小核酸分子 ，，bDNA手艺较于Hybrid-immnoassays 相对更容易增进Assay的迅速度。。。。。4. bDNA在小滋扰RNA（siRNA）剖析上的应用
基于bDNA手艺举行siRNA的剖析 ，，实质上也是针对其中的一条链构建特异性探针和举行信号放大 ，，反应原理图类似于ASO ，，因此本文不再单独用图展示 ，，仍可拜见【图5】。。。。。然而 ，，bDNA在用于构建ASO和siRNA剖析要领时也有着很大的区别 ，，ASO是单链 ，，而siRNA是双链结构 ，，因此在bDNA手艺应用于ASO要相关于siRNA容易实现 ；；；；；；siRNA在使用bDNA手艺平台构建剖析要领时挑战相对较大 ，，由于siRNA自身双链特征 ，，关于siRNA样品需要多一个变性的办法 ，，而变性后又要避免在退火杂交时互补链自身的复性连系而影响了捕获探针和检测探针与目的链的连系 ，，这是差别于单链RNA的最大担心。。。。。
探针序列的选择和退火孵育温度的探索很是主要 ，，另外同样也阻止不了稳固性和差别基质的影响 ，，siRNA各反应条件在要领开发中的探索越发重大 ，，这些都是此手艺应用于siRNA剖析实践中的需要个性化战胜的主要的挑战。。。。。一旦这些基本问题获得战胜 ，，也可以开发出很高迅速度的siRNA剖析要领 ，，下面图表即为yl23455永利实验室基于bDNA手艺剖析血浆中某siRNA的案例展示 ，，如【表3】所示可以做到个位数的pg级迅速度 ，，无论是ULOQ（80pg/mL）照旧LLOQ（1.25pg/mL）各浓度的差别套质控样品都能抵达古板PK剖析要领的接纳率接受规模【图7】 ，，此迅速度下的仪器响应值相对不高但仍能执行很好的一次方程线性拟合【图8】。。。。。表 3 bDNA检测某siRNA-X的标准曲线数据
关于小寡核苷酸 ，，bDNA除了应用于ASO及siRNA以外 ，，还可以用于miRNA和核酸适配体等种种小核酸分子 ，，应用原理与形式总体与前两者类似 ，，且miRNA及核酸适配体（一个上市退却市）现在未见正式成药 ，，也就不在此文赘述。。。。。
综上所述 ，，bDNA手艺是一种可以很好的可普遍应用于种种核酸检测的手艺 ，，无论是长的mRNA ，，照旧短的小寡核苷酸 ，，相较于LC-MS/MS或HRMS及Hybrid-immunoassays等系列手艺 ，，其相对更容易提升迅速度。。。。。现在基因治疗领域已经有越来越多的核酸药物使用特殊的局部给药方法 ，，常涉及到特殊的取材如脑脊液 ，，小动物尿液、甚至尚有一些是活检组织样品。。。。。因此 ，，对相关生物剖析也提出了高迅速度低样品消耗的更高的现实需求 ，，也是相关医药研发事情者的现实需求 ，，bDNA恰是知足此类需求一种很好的手艺。。。。。关于mRNA的剖析 ，，古板的RT-qPCR方法虽然可以剖析且也有很高的迅速度 ，，但因核酸的提取办法繁杂不可能阻止抽提历程中核酸的绝对损失 ，，并且差别的提取试剂、职员或提取仪器都会有差别 ，，这些都潜在令qPCR要领的现实迅速度有所折扣。。。。。bDNA手艺阻止了这些前处置惩罚历程的影响 ，，并且可以做到用单位体积目的剖析物拷贝数作为其绝对定量单位 ，，且bDNA手艺要领一旦开发出来要比qPCR的要领稳健得多 ，，可以用古板的药代生物剖析的行业手艺吸收标准来对此类要领举行约束质控。。。。。这是其与qPCR手艺有显著区别的地方。。。。。基于yl23455永利生物剖析实验室的周全应用和体验 ，，bDNA手艺无疑是有显著优势和应用价值的适于医药研发工业领域的核酸检测手艺。。。。。bDNA虽然是一项较量优越的手艺 ，，可是现实应用于种种核酸分子剖析中并非是可以一蹴而就的 ，，同样需要较重大的要领开发和优化历程。。。。。同Hybrid-immunoassays一样 ，，这类手艺要领高度依赖特异性探针的设计去成绩其要领的特异性 ，，在种种探针齐全的条件下仍然要破费较长的时间和精神探索反应条件及种种反应缓冲液的配方甚至调解差别探针的反应模式、反应系统和反应顺序等系列条件才华开发建设出一套知足适用的剖析要领。。。。。正如前文指出 ，，bDNA在被使用于种种型核酸剖析中 ，，关于mRNA、单链寡核苷酸（ASO）和双链寡核苷酸（siRNA）其应用难度是递进的 ，，并且每一个类型核酸中详细药物分子的bDNA要领也都是个性化的 ，，难度因分子自己而异 ，，需要针对详细分子的序列和特点举行剖析要领的开发。。。。。在生物剖析要领开发上 ，，bDNA手艺并没有比其它类型要领显著节约时间和精神 ，，并且bDNA手艺因其探针结构特殊性 ，，该要领的应用本钱要高于其它核酸剖析手艺。。。。。然而 ，，一旦基于bDNA手艺原理的要领开发乐成 ，，则具有非？？？？煽康奈冉⌒院椭叵中。。。。。bDNA手艺还可以执行多重检测 ，，其所涉及到的双“Z”型探针或其它延伸探针及信号放大系统不但可以直接用于核酸的检测 ，，还可以拓展到其它的剖析检测平台上。。。。。Thermo公司就将这类探针手艺运用到流式平台针对细胞层面的转录本检测中 ，，牢靠并破膜的细胞可直接与特异的延伸标记探针孵育基于信号放大系统举行信号放大 ，，最后被流式检测 ，，此手艺被命名为PrimeFlow RNA剖析手艺。。。。。除了在流式平台的拓展应用外 ，，双“Z”型探针及信号放大系统还可以被组织细胞的目的RNA原位杂交RNAscope手艺所应用 ，，从而使RNA原位杂交具有高度特异性、提高单分子检测的敏感性并带来极高的信噪比 ，，能够在单细胞水平同步定量多个RNA的表达 ，，在获得单细胞中单拷贝RNA表达数据的同时提供完整的组织形态学信息 ，，这也是小核酸研发领域基于组织学水平考察药物漫衍所需要的手艺。。。。。只管现在在海内医药研发领域bDNA手艺的应用相对较少 ，，但随着基因治疗药物尤其是其分支领域核酸类药物的蓬勃生长 ，， bDNA将会逐步走入宽大研发职员视野 ，，该手艺的性能将被越来越多的人认知和认可。。。。。
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