急性毒性试验常用要领及试验设计原理综述

急性毒性试验/重复给药筛选试验

急性毒性评价是体内清静性评价的基本类型之一，，药品注册通常需要开展急性毒性评价。
。。。。。急性毒性试验所得数据在清静性评价中具有主要作用，，可在起源毒性特征形貌中用于确定最大耐受剂量（MTD）或最小致死剂量（MFD）。
。。。。。这些数据还可为清静药理学试验及重复给药毒性试验的剂量选择提供依据。
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别的，，急性毒性试验可用于早期候选药物的筛。
。。。。。，亦可与简朴的重复给药毒性筛选试验联合开展。
。。。。。需要注重的是，，只有在获得与给药途径和临床顺应症相关的生物使用度及系统袒露数据的条件下，，急性毒性研究效果才华提供更具价值的清静性信息。
。。。。。

（一）急性毒性（重复给药筛选试验）

急性毒性试验可接纳多种研究形式，，但其主要目的基本一致，，即评估候选药物在临床预期剂量若干倍水平下的耐受性。
。。。。。筛选试验的优势在于可在统一研究中同时较量多个候选化合物。
。。。。。耐受性指标（如体重转变、饲料消耗量转变及异常临床症状等）可为判断候选药物的相对清静性提供参考依据。
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在此类研究中，，动物品种的选择通常不要求笼罩所有动物种属，，但至少应评价一种啮齿类动物。
。。。。。关于拟恒久逐日给药的药物，，在5～7天的袒露周期内开展重复给药耐受性评价也是可行的，，这有助于起源评估临床病理学终点的潜在转变，，并为后续毒性试验的剂量设计提供参考。
。。。。。但该类筛选试验不可替换用于注册申报的正式急性毒性试验。
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（二）急性毒性试验的基本设计

急性毒性试验通常设置每组动物数目相对较少的多个剂量组。
。。。。。关于啮齿类动物研究，，每个剂量组每个性别设置5只动物一样平常已足够；；第二种动物品种通常每组使用2～3只动物。
。。。。。试验中应设置溶媒比照组，，并至少设置3个供试品剂量组；；在对供试品毒理学特征相识有限的情形下，，可适当增添剂量组数目。
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在单次给予供试品后，，应对动物的体重、饲料消耗量及临床症状举行系统视察，，以获取毒理学作用的要害信息。
。。。。。在划定视察期竣事后（通常为给药后第14天），，对存活动物实验愉逸死并举行概略剖解检查，，重点评估组织和器官的肉眼可见病变。
。。。。。一样平常情形下，，不再对上述组织举行进一步的组织病理学检查。
。。。。。

急性毒性评价通常着重于显着毒性反应的视察，，包括体重转变、饲料消耗镌汰、殒命或濒死体现，，以及与供试品相关的药理学作用等临床指标。
。。。。。急性毒性试验效果可为后续重复给药毒性试验的剂量设计提供主要参考。
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急性毒性试验效劳项目：

考察受试药物在小鼠中的半数致死量（LD??）或最大耐受剂量（Maximum Tolerated Dose，，MTD）。
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半数致死量（Median Lethal Dose，，LD??）：在一定试验条件下，，可引起 50% 的受试动物殒命的剂量，，该数值通过统计学要领盘算获得。
。。。。。
最大耐受剂量（Maximum Tolerated Dose，，MTD）：在既定试验条件下，，不引起受试动物殒命且未泛起显着不可接受毒性反应的最高给药剂量。
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效劳内容：

1、开展小鼠急性毒性预试验，，用于确定合理的剂量设计；；
2、 凭证受试药物的理化性子和作用特点，，选择合适的给药途径，，包括灌胃、静脉注射、腹腔注射和皮下注射等；；
3、 对泛起异常体现的动物举行须要的病理组织学检查。
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一、概述

动物急性毒性试验（Acute toxicity test，，Single dose toxicity test）

是指研究动物在一次给药或在 24 小时内多次给予受试物后，，于一定视察期内所爆发的毒性反应。
。。。。。拟用于人体的药物通常需要开展动物急性毒性试验。
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急性毒性试验处于药物毒理学研究的早期阶段，，关于剖析药物的毒性作用特征及识别潜在毒性靶器官具有主要意义。
。。。。。急性毒性试验所获得的信息可为恒久毒性试验的剂量设计以及部分药物Ⅰ期临床试验起始剂量的选择提供主要参考，，并可提供与人类药物过量所致急性中毒相关的基础信息。
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急性毒性试验的设计应在充分相识受试物相关信息的基础上，，遵照“详细问题详细剖析”的原则。
。。。。。应凭证化合物的结构特点、理化性子、顺应症特征及试验目的等因素，，选择合理的试验要领，，制订相宜的试验计划，，并连系其他药理学和毒理学研究效果，，对试验数据举行周全评价。
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急性毒性试验应遵照一样平常动物试验的基来源则，，即随机、比照和可重复性。
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二、基本看法

最大无毒性反应剂量（未见不良反应剂量，，No Observed Adverse Effect Level，，NOAEL）：

指受试物在一准时间内以特定方法给予机体，，在接纳迅速的检测要领和视察指标的条件下，，未视察到任何不良反应的最高剂量。
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最小毒性反应剂量：

动物泛起毒性反应的最小剂量。
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最大耐受剂量（Maximum Tolerated Dose，，MTD）：

指在划定试验条件下，，动物可耐受且未泛起殒命或不可接受毒性反应的最高给药剂量。
。。。。。

最小致死剂量（Minimal Lethal Dose，，MLD）：

指在一定试验条件下，，引起个体受试动物殒命的最低剂量。
。。。。。

半数致死量（Median Lethal Dose，，LD??）：

指在一定试验条件下，，引起 50% 的受试动物殒命的剂量，，该数值通过统计学要领盘算获得。
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三、研究内容

（一）受试物

急性毒性试验所用受试物应为制备工艺稳固、切合临床试验用质量标准要求的样品。
。。。。。应明确注明受试物的名称、泉源、批号、含量（或规格）、生涯条件及配制要领等信息，，并附研制单位出具的自检报告。
。。。。。所用辅料、溶媒等亦应注明其批号、规格和生产厂家，，并切合试验相关要求。
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（二）动物

1.种属：
差别种属动物具有各自的心理特点，，对统一药物的毒性反应可能保存差别。
。。。。。啮齿类动物与非啮齿类动物急性毒性试验所得效果在毒性体现的性子和水平上均可能差别。
。。。。。为充分表征受试物的毒性特征，，应从啮齿类动物和非啮齿类动物中获得较为周全的清静性信息。
。。。。。因此，，急性毒性试验原则上应接纳至少两种哺乳动物，，一样平常选用一种啮齿类动物和一种非啮齿类动物。
。。。。。如未接纳非啮齿类动物，，应对其合理性作出说明。
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2.性别：
通常应接纳两种性别的试验动物，，牝牡各半；；如仅接纳简单性别动物举行试验，，应剖析其科学依据和合理性

3.年岁：
通常接纳康健成年动物举行试验。
。。。。。若是受试物拟用于儿童或可能用于儿童，，建议须要时接纳幼年动物举行试验。
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4.动物数：
试验动物数目应凭证动物种属和研究目的合理确定，，并知足试验要领及效果剖析评价的需要。
。。。。。在包管获得充分信息的条件下，，应只管镌汰动物使用数目

5.体重：
试验动物的初始体重不应凌驾或低于平均体重的 20%。
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可凭证试验目的及受试物特点，，综合确定试验动物的性别、年岁等条件。
。。。。。所有试验动物均应切合国家有关实验动物品级要求，，泉源、品系及遗传配景清晰，，并具有实验动物质量及格证实。
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（三）给药途径

差别给药途径会影响受试物的吸收速率、吸收率及系统袒露珠平，，因此急性毒性试验可接纳差别的给药途径。
。。。。。通过较量差别给药途径下的毒性效果，，还可获得起源的生物使用度相关信息。
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一样平常情形下，，给药途径应至少包括临床拟用途径以及一种能够使真相药物较完全进入体循环的途径（如静脉注射）。
。。。。。若临床拟用途径自己为静脉给药，，则仅接纳该途径即可。
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经口给药前，，动物通常需禁食一段时间（一样平常为一夜），，但不禁水。
。。。。。由于胃内容物可能影响给药容量，，而禁食时间的是非亦可能影响啮齿类动物药物代谢酶活性及肠道吸收，，从而影响毒性袒露珠平。
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（四）给药剂量水平

急性毒性试验的重点在于视察动物的毒性反应体现。
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。。。。。关于非啮齿类动物，，给药剂量抵达泛起显着毒性反应即可，，通常无须抵达致死水平。
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总体而言，，给药剂量应笼罩从未见毒性反应剂量至泛起严重（危及生命）毒性反应的剂量规模，，并设置空缺比照组和/或溶媒（辅料）比照组。
。。。。。差别动物种属及给药途径下的最大给药容量可参考相关文献并连系现真相形确定。
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（五）视察时间及指标

给药后，，一样平常一连视察至少14天，，视察的距离和频率应合理设置，，以便能视察到毒性反应泛起的时间及其恢复时间、动物殒命时间等。
。。。。。视察的指标包括一样平常指标（如动物外观、行为、对刺激的反应、渗透物、渗透物等）、动物殒命情形（殒命时间、濒死前反应等）、动物体重转变（给药前及试验竣事正法前至少各称重一次，，视察时代可适当增添称重次数）等。
。。。。。纪录所有的殒命情形、泛起的症状，，以及症状起始的时间、严重水平、一连时间等。
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（六）病理学检查

所有的试验动物均应举行概略剖解，，包括试验历程中因濒死而正法的动物、殒命的动物以及试验竣事时仍存活的动物。
。。。。。凡发明组织或器官在体积、颜色或质地等方面泛起异常改变，，均应予以纪录，，并进一步举行组织病理学检查。
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四、数据剖析及评价

（一）效果处置惩罚和剖析

1.凭证所视察到的种种反应泛起的时间、严重水平、一连时间等，，剖析种种反应在差别剂量水平下的爆发率、严重水平。
。。。。。凭证视察效果归纳剖析，，判断每种反应的剂量－反应关系和时间－反应关系。
。。。。。
2.连系临床视察效果，，判断已泛起的毒性反应可能涉及的组织、器官或系统。
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3.凭证概略剖解中视察到的肉眼可见病变及组织病理学检查效果，，起源判断可能的毒性靶器官。
。。。。。组织病理学检查应形陋习范的病理学报告，，并由病理学检查认真人署名，，同时加盖药品注册申请人公章；；对保存病变的组织应提供响应的病理学照片。
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4.综合差别剂量组的毒性反应类型、爆发率及动物殒命情形，，确定动物对受试物的未见毒性反应剂量和严重毒性反应剂量。
。。。。。为此，，可接纳适当的试验和评价要领，，测定最大无毒性反应剂量或最小毒性反应剂量，，以及最大耐受剂量、近似致死剂量或最小致死剂量等，，以起源界定受试物的清静规模。
。。。。。
5. 关于需要测定LD50的药物，，应接纳合理的统计学要领对其举行求算。
。。。。。
6. 说明所使用的盘算要领和统计学要领，，并提供所选要领合理性的依据。
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（二）综合评价

综合思量差别剂量水平下毒性反应的泛起时间、爆发率、剂量–反应关系，，以及差别动物种属、实验室历史比照数据、病理学检查效果和同类药物的毒性特征，，判断视察到的毒性反应与受试物之间的相关性。
。。。。。
在此基础上，，总结受试物的清静规模、毒性反应的严重水平及其可逆性；；并连系毒性可能涉及的部位，，综合概略剖解和组织病理学检查效果，，起源判断其毒性作用靶器官。
。。。。。
急性毒性试验效果可为后续毒理学研究的剂量选择提供依据，，并提醒后续研究中需重点关注的毒性指标。
。。。。。别的，，通过较量差别给药途径下动物的反应情形，，可对受试物的生物使用度作出起源判断，，为剂型开发提供参考。
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五、急性毒性试验常用试验要领

由于受试物的化学结构和活性因素含量差别，，其毒性反应的类型和强度亦保存差别。
。。。。。因此，，研究者应凭证受试物的特点，，选择以下试验要领，，或接纳海内外公认的其他急性毒性试验要领。
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1. 近似致死剂量法

该要领主要用于非啮齿类动物的急性毒性试验，，试验要领如下：

一样平常接纳6 只康健的Beagle 犬或猴。
。。。。。犬的年岁一样平常为4-6 月龄，，猴的年岁一样平常为2-3 岁，，如选用其他动物种属，，应说明其科学依据和合理性。
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凭证小动物毒性试验效果、受试物的化学结构及其他相关资料，，预计可能引起毒性反应和殒命的剂量规模，，并按 50% 递增原则设计包括多个剂量水平的剂量序列表。
。。。。。

凭证预计，，由剂量序列表中找出可能的致死剂量规模，，在此规模内，，每距离一个剂量给予一只动物，，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，，随后，，选取两者之间的中心剂量再给予 1 只动物。
。。。。。若是该剂量下动物未爆发殒命，，则该剂量与最低致死剂量之间的规模可作为近似致死剂量规模；；若是该剂量下动物殒命，，则该剂量与最高非致死剂量间的规模可作为近似致死剂量规模。
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2. 最大给药量法

关于某些毒性较低的受试物，，可接纳最大给药量法举行急性毒性评价。
。。。。。在合理确定最大给药浓度和给药容量的条件下，，以允许的最大剂量举行单次给药，，或在 24 小时内多次给药（总剂量一样平常不凌驾 5 g/kg 体重），，视察动物泛起的毒性反应。
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该要领通常使用 10～20 只试验动物，，给药后一连视察不少于 14 天。
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3. 牢靠剂量法（Fixed-dose procedure）

牢靠剂量法最初于 1984 年由英国毒理学会提出。
。。。。。该要领不以动物殒命作为主要视察终点，，而是以明确且可视察到的毒性体征作为评价依据。
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试验通常选择 5、50、500 和 2000 mg/kg 四个牢靠剂量举行研究；；在特殊情形下，，可增添 5000 mg/kg 剂量。
。。。。。试验动物首选大鼠。
。。。。。给药前禁食 6～12 小时，，给药后继续禁食 3～4 小时。
。。。。。试验接纳一次给药方法举行。
。。。。。若无资料批注雄性动物对受试物更为敏感，，预试应首先接纳雌性动物。
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凭证受试物的相关资料，，从上述四个剂量中选择一个作为初始剂量；；如缺乏可供参考的资料，，可选用500mg/kg作为初始剂量举行预试。
。。。。。若该剂量未泛起毒性反应，，则可接纳 2000 mg/kg 举行预试；；如在该剂量下未视察到动物殒命，，可终止预试。
。。。。。若初始剂量泛起严重的毒性反应，，即降低一个层次的剂量举行预试，，云云时动物存活，，就在此两个牢靠剂量之间选择一其中心剂量举行试验。
。。。。。每个剂量给一只动物，，预试一样平常不凌驾5只动物。
。。。。。每个剂量试验之间至少应距离24小时。
。。。。。给受试物后的视察期至少7天，，如动物的毒性反应到第7天仍然保存，，尚应继续视察7天。
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在上述预试的基础上举行正式试验。
。。。。。每个剂量至少用10只动物，，牝牡各半。
。。。。。凭证预试的效果，，在上述四种剂量中选择一个可能爆发显着毒性但不导致殒命的剂量用于正式试验；；如预试效果批注，，5.0mg/kg 即可引起动物殒命，，则应降低一个剂量层次举行正式试验。
。。。。。

给药后视察期不少于 2 周，，凭证毒性反应的详细特点可适当延伸。
。。。。。对每只动物均应仔细视察并详细纪录种种毒性反应泛起和消逝的时间。
。。。。。给药当天至少应视察纪录两次，，以后可天天一次。
。。。。。视察纪录的内容包括皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为体现等。
。。。。。动物殒命时间的纪录要准确。
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给予受试物前、后各1周、动物殒命及试验竣事时应称取动物的体重。
。。。。。所有动物包括殒命或正法的动物均应举行尸检，，尸检异常的器官应作组织病理学检查。
。。。。。牢靠剂量法试验效果应参照响应评价标准举行判断。
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4. 上下法（蹊径法，，序贯法，，Up and down method）

该要领由Dixon和Mood首次提出，，1985年Bruce对其举行了刷新，，现在是OECD和EPA推荐的急性毒性试验要领之一。
。。。。。该要领的主要特点是可显著镌汰试验动物的使用数目，，同时不但能够视察毒性体现，，还可估算 LD?? 及其置信区间，，适用于可能引起试验动物快速殒命的受试物。
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上下法包括限度试验和主试验两部分。
。。。。。限度试验主要用于已有资料提醒受试物毒性可能较低的情形，，相关毒性信息可泉源于与受试物相关的化合物、类似混淆物或产品。
。。。。。当相关毒性资料较少或缺乏，，或预期受试物具有显着毒性时，，应直接开展主试验。
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限度试验：是一种最多用5 只动物举行的序列试验。
。。。。。常用试验剂量为2000 mg/kg，，在特殊情形下也可使用5000 mg/kg。
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2000 mg/kg剂量水平的限度试验: 将受试物给予1 只动物。
。。。。。若是该动物殒命，，则举行主试验；；若是该动物存活，，依次将受试物给予另外4只动物，，动物总数为5只。
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若是1 只动物在试验后期殒命，，而其他动物存活，，应阻止对其他动物给药，，对所有动物举行视察，，是否在相似的视察时代也爆发殒命。
。。。。。后期殒命的动物应与其他殒命的动物同样计数，，对效果举行如下评价: 有3 只或3 只以上动物殒命时，，LD50小于2000mg/kg；；有3只或3只以上动物存活时，，LD50大于2000 mg/kg；；若是有3 只动物殒命，，则举行主试验。
。。。。。

5000mg/kg剂量水平的限度试验:特殊情形下，，可思量使用5000mg/kg的剂量。
。。。。。将受试物给予1只动物。
。。。。。若是该动物殒命，，则举行主试验；；若是该动物存活，，将受试物给予另外2只动物。
。。。。。若是这2只动物都存活，，则LD50大于5000mg/kg，，阻止试验（即不再对其他动物给药，，视察14天）。
。。。。。若是这2只动物中有1只殒命或者2只均殒命，，将受试物给予另外2只动物，，一次1只。
。。。。。若是1只动物在试验后期殒命，，而其他动物存活，，应阻止对其他动物给药，，对所有动物举行视察，，是否在相似的视察时代也爆发殒命。
。。。。。后期殒命的动物应与其他殒命的动物同样计数，，对效果举行如下评价。
。。。。。有3只或3 只以上动物殒命时，，LD50小于5000 mg/kg；；有3 只或3 只以上动物存活时，，LD50大于5000 mg/kg。
。。。。。

主试验:由一个设定的给药程序组成，，在此程序中，，每次给药1只动物，，距离至少48小时。
。。。。。给药距离取决于毒性泛起时间、一连时间和毒性的严重水平。
。。。。。在确信前一只动物给药后能存活之前，，应推迟按下一剂量给药。
。。。。。时间距离可以适当调解，，但使用简单时间距离时，，试验会更轻盈。
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第一只动物的给药剂量低于LD50的最靠近的预计值。
。。。。。若是该动物存活，，第二只动物给予高一级剂量；；若是第一只动物殒命或泛起濒死状态，，第二只动物给予低一级剂量。
。。。。。剂量级数因子应选定为1/（剂量-反应曲线斜率预计值）的阻挡数（对应于斜率2的级数因子为3.2），，并应在整个试验历程中坚持稳固。
。。。。。当没有受试物的斜率的有关资料时，，使用3.2为剂量级数因子。
。。。。。

使用默认级数因子时，，剂量应从以下序列中选择：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000mg/kg（或有特殊要求时1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000mg/kg）。
。。。。。若是没有受试物的致死预计值，，应该从175mg/kg最先。
。。。。。若是预期动物对该受试物的耐受水平转变很大（即，，预计斜率小于2.0），，那么最先试验前应思量增添剂量级数因子凌驾按对数剂量盘算的默认值0.5（即，，级数因子为3.2）。
。。。。。同样，，关于已知斜率很陡的受试物，，应选择小于默认值的级数因子。
。。。。。

在决议是否及怎样对下一只动物给药之前，，每只动物都应认真视察达48小时。
。。。。。当知足阻止试验标准之一时，，阻止给药，，同时凭证终止时所有动物的状态盘算LD50预计值和可信区间。
。。。。。 用最大可能性法盘算LD50值 (美国EPA开发了响应的盘算软件，，AOT425StatPgm)。
。。。。。

当知足下列阻止试验标准之一时，，阻止试验：

（a） 一连3 只动物存活；；

（b） 恣意一连6 只试验动物，，有 5 次一连爆发涯活/殒命状态转换；；

（c） 第一只动物爆发转换之后至少有4 只动物进入试验，，并且其LD50估算值的规模凌驾临界值（2.5 倍）。
。。。。。（首次转换的第4 只动物之后，，对每次给药举行盘算）。
。。。。。

关于LD50和斜率的种种组合，，在动物爆发殒命/存活转换之后，，用4~6只动物即可知足阻止试验标准（C）。
。。。。。但在一些情形下，，化合物的剂量-反应曲线的斜率较。
。。。。。，可能另外还需要增添动物（总共可达15 只）。
。。。。。

5. 累积剂量设计法（金字塔法，，Pyramiding dosage design）

在非啮齿类动物的急性毒性试验中可接纳该要领。
。。。。。经典的试验设计通常需要8只动物，，设置比照组和给药组，，每组4只动物，，牝牡各2只。
。。。。。

剂量的设计可以是1、3、10、30、100、300、1000、3000mg/kg，，也可以接纳10、20、40、80、160、320、640、1280mg/kg，，通常隔日给予下一个高剂量，，剂量逐渐加大，，直到泛起动物殒命时或抵达剂量上限时为止。
。。。。。

当没有动物殒命时，，MLD（最小致死剂量）和LD50大于最高剂量或受限制剂量。
。。。。。当在某一剂量所有动物均泛起殒命时，，MLD和LD50应在最后两个剂量之间。
。。。。。当在某一剂量部分动物泛起殒命，，部分殒命泛起在后继的下一个高剂量，，此时，，MLD位于首次泛起殒命的剂量和前一低剂量之间，，LD50则应在首次泛起动物殒命的剂量和所有动物均殒命的剂量之间。
。。。。。

若整个试验历程中未泛起动物殒命，，经常以最高剂量给予动物5-7 天，，以为后续重复给药毒性试验中高剂量的选择提供依据。
。。。。。

6. 半数致死量法

半数致死量法是一种经典的急性毒性试验要领，，通过对试验效果举行统计学剖析，，可获得受试物的半数致死量（LD??）