ELISA的原理和类型

一、ELISA的原理

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。。
。连系在固相载体外貌的抗原或抗体仍坚持其免疫学活性，，，，，，酶标记的抗原或抗体既保存其免疫学活性，，，，，，又保存酶的活性。。
。在测准时，，，，，，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体外貌的抗原或抗体起反应。。
。用洗涤的要领使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质脱离。。
。再加入酶标记的抗原或抗体，，，，，，也通过反应而连系在固相载体上。。
。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。。
。加入酶反应的底物后，，，，，，底物被酶催化成为有色产品，，，，，，产品的量与标本中受检物质的量直接相关，，，，，，故可凭证呈色的深浅举行定性或定量剖析。。
。由于酶的催化效率很高，，，，，，间接地放大了免疫反应的效果，，，，，，使测定要领抵达很高的敏感度。。
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二、ELISA的类型

ELISA可用于测定抗原，，，，，，也可用于测定抗体。。
。在这种测定要领中有三个须要的试剂：
（1）固相的抗原或抗体，，，，，，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；；；
（2）酶标记的抗原或抗体，，，，，，称为“酶联物”、“连系物”（conjugate）；；；
（3）酶反应的底物。。
。凭证试剂的泉源和标本的情形以及检测的详细条件，，，，，，可设计出州差别类型的检测要领。。
。用于临床磨练的ELISA主要有以下几种类型：

（一）　双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法是检测抗原最常用的要领，，，，，，操作办法如下：
（1） 将特异性抗体与固相载体联络，，，，，，形成固相抗体。。
。洗涤除去未连系的抗体及杂质。。
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（2） 加受检标本，，，，，，保温反应。。
。标本中的抗原与固相抗体连系，，，，，，形成固相抗原抗体复合物。。
。洗涤除去其他未连系物质。。
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（3） 加酶标抗体，，，，，，保温反应。。
。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体连系。。
。彻底洗涤未连系的酶标抗体。。
。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。。
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（4） 加底物显色。。
。固相上的酶催化底物成为有色产品。。
。通过比色，，，，，，测知标本中抗原的量。。
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在临床磨练中，，，，，，此法适用于磨练种种卵白质等大分子抗原，，，，，，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。。
。只要获得针对受检抗原的异性抗体，，，，，，就可用于包被固相载体和制备酶连系物而建设此法。。
。如抗体的泉源为抗血清，，，，，，包被和酶标用的抗体最好划分取自差别种属的动物。。
。如应用单克隆抗体，，，，，，一样平常选择两个针对抗原上差别决议簇的单抗，，，，，，划分用于包被固相载体和制备酶连系物。。
。这种双位点夹心法具有很高的特异性，，，，，，并且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，，，，，，作一步法检测。。
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在一步法测定中，，，，，，当标本中受检抗原的含量很高时，，，，，，过量抗原划分和固相抗体及酶标抗体连系，，，，，，而不再形成"夹心复合物"。。
。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带征象，，，，，，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，，，，，，如按常法测读，，，，，，所得效果将低于现实的含量，，，，，，这种征象被称为钩状效应（hook effect），，，，，，由于标准曲线抵达岑岭后呈钩状弯落。。
。钩状效应严重时，，，，，，反应甚至可不显色而泛起假阴性效果。。
。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，，，，，，应注重可测规模的最高值。。
。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。。
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倘使在被测分子的差别位点上含有多个相同的决议簇，，，，，，例如HBsAg的a决议簇，，，，，，也可用针对此决议的统一单抗划分包被固相和制备酶连系物。。
。但在HBsAg的检测中应注重亚型问题，，，，，，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，，，，，，显然每种亚型均有相同的a决议簇的反应性，，，，，，这也是用单抗作夹心法应注重的问题。。
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双抗体夹心法测抗原的另一注重点是类风湿因子（RF）的滋扰。。
。RF是一种自身抗体，，，，，，多为IgM型，，，，，，能和多种动物IgG的Fc段连系。。
。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，，，，，，它可充当抗原成份，，，，，，同时与固相抗体和酶标抗体连系，，，，，，体现出假阳性反应。。
。接纳F（ab'）或Fab片断作酶连系物的试剂，，，，，，由于去除了Fc段，，，，，，从而可消除RF的滋扰。。
。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，，，，，，已被列为这类试剂的一项审核指标。。
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双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，，，，，，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，，，，，，因其不可形成两位点夹心。。
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（二）双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。。
。用特异性抗原举行包被和制备酶连系物，，，，，，以检测响应的抗体。。
。与间接法测抗体的差别之处为以酶标抗原取代酶标抗抗体。。
。此法中受检标本不需稀释，，，，，，可直接用于测定，，，，，，因此其敏感度相对高于间接法。。
。乙肝标记物中抗HBs的检测常接纳本法。。
。本法要害在于酶标抗原的制备，，，，，，应凭证抗原结构的差别，，，，，，寻找合适的标记要领。。
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（三） 间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的要领。。
。其原理为使用酶标记的抗抗体（抗人免疫球卵白抗体）以检测与固相抗原连系的受检抗体，，，，，，故称为间接法（见图2-3）。。
。操作办法如下：
（1）将特异性抗原与固相载体联络，，，，，，形成固相抗原。。
。洗涤除去未连系的抗原及杂质。。
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（2）加稀释的受检血清，，，，，，保温反应。。
。血清中的特异抗体与固相抗原连系，，，，，，形成固相抗原抗体复合物。。
。经洗涤后，，，，，，固相载体上只留下特异性抗体，，，，，，血清中的其他成份在洗涤历程中被洗去。。
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（3）加酶标抗抗体。。
？？？？？？捎妹副昕谷薎g以检测总抗体，，，，，，但一样平常多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。。
。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体连系，，，，，，从而间接地标记上酶。。
。洗涤后，，，，，，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。。
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（4）加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而举行熏染病的诊断。。
。间接法的优点是只要变换包被抗原就可使用统一酶标抗抗体建设检测响应抗体的要领。。
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间接法乐成的要害在于抗原的纯度。。
。虽然有时用粗提抗原包被也能取得现实有用的效果，，，，，，但应尽可能予以纯化，，，，，，以提高试验的特异性。。
。特殊应注重除去能与一样平常康健人血清爆发反应的杂质，，，，，，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，，，，，，如其中含有E.Coli成份，，，，，，很可能与受过E.Coli熏染者血清中的抗E.Coli抗体爆发反应。。
？？？？？？乖幸膊豢珊杏朊副昕谷薎g反应的物质，，，，，，例如来自人血浆某人体组织的抗原，，，，，，如不将其中的Ig去除，，，，，，试验中也爆发假阳性反应。。
。另外如抗原中含有无关卵白，，，，，，也会因竟争吸附而影响包被效果。。
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间接法中另一种滋扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。。
。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。。
。IgG的吸附性很强，，，，，，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，，，，，，有时也可吸附到包被抗原的外貌。。
。因此在间接法中，，，，，，抗原包被后一样平常用无关卵白质（例如牛血清卵白）再包被一次，，，，，，以关闭（blocking）固相上的空余间隙。。
。另外，，，，，，在检测历程中标本须先行稀释（1:40~1:200），，，，，，以阻止过高的阴性本底影响效果的判断。。
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（四）竞争法测抗体
当抗原质料中的滋扰物质不易除去，，，，，，或不易获得足够的纯化抗原时，，，，，，可用此法检测特异性抗体。。
。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原连系。。
。标本中抗体量越多，，，，，，连系在固相上的酶标抗体愈少，，，，，，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。。
。如抗原为高纯度的，，，，，，可直接包被固相。。
。如抗原中会有滋扰物质，，，，，，直接包被不易乐成，，，，，，可接纳捕获包被法，，，，，，即先包被与固相抗原响应的抗体，，，，，，然后加入抗原，，，，，，形成固相抗原。。
。洗涤除去抗原中的杂质，，，，，，然后再加标本和酶标抗体举行竞争连系反应。。
。竞争法测抗体有多种模式，，，，，，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争连系，，，，，，抗HBc ELISA一样平常接纳此法。。
。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中举行竞争连系，，，，，，洗涤后再加入酶标抗体，，，，，，与连系在固相上的抗原反应。。
？？？？？？笻Be的检测一样平常接纳此法。。
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（五）竞争法测抗原
小分子抗原或半抗缘故原由缺乏可作夹心法的两个以上的位点，，，，，，因此不可用双抗体夹心法举行测定，，，，，，可以接纳竞争法模式。。
。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体连系。。
。标本中抗原量含量愈多，，，，，，连系在固相上的酶标抗原愈少，，，，，，最后的显色也愈浅。。
。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。。
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（六）捕获包被法测抗体（经典要领）
IgM抗体的检测用于熏染病的早期诊断中。。
。间接法ELISA一样平常仅适用于检测总抗体或IgG抗体。。
。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，，，，，，因标本中一样平常同时保存较高浓度的IgG抗体，，，，，，后者将竞争连系固相抗原而使一部份IgM抗体不可连系到固相上。。
。因此如用抗人IgM作为二抗，，，，，，间接测定IgM抗体，，，，，，必需先将标本用A卵白或抗IgG抗体处置惩罚，，，，，，以除去IgG的滋扰。。
。在临床磨练中测定抗体IgM时多接纳捕获包被法。。
。先用抗人IgM抗体包被固相，，，，，，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。。
。然后加入抗原，，，，，，此抗原仅与特异性IgM相连系。。
。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。。
。再与底物作用，，，，，，呈色即与标本中的IgM成正相关。。
。此法常用于病毒性熏染的早期诊断。。
。甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式见图2-7.
类风湿因子（RF）同样能滋扰捕获包被法测定IgM抗体，，，，，，导致假阳性反应。。
。因其中和IgG的间接法迩来颇受青睐，，，，，，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获乐成。。
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（七）ABS-ELISA法
ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。。
。亲和素是一种糖卵白，，，，，，分子量60000，，，，，，每个分子由4个能和生物素连系的亚基组成。。
。生物素为小分子化合物，，，，，，分子量244.用化学要领制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与卵白质和糖等多种类型的巨细分子形成生物素标记产品，，，，，，标记要领颇为轻盈。。
。生物素与亲和素的连系具有很强的特异性，，，，，，其亲和力较抗原抗体反应大得多，，，，，，两者一经连系就极为稳固。。
。由于一个亲和素可与4个生物素分子连系，，，，，，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。。
。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）取代原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。。
。在LAB中，，，，，，固相生物素先与不标记的亲和素反应，，，，，，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。。
。在早期，，，，，，亲和素从蛋清中提取，，，，，，这种卵亲和素为碱性糖卵白，，，，，，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，，，，，，用于ELISA中可使本底增高。。
。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此弱点，，，，，，在ELISA应用中有替换前者的趋势。。
。由于ABS-ELISA较通俗ELISA多用了两种试剂，，，，，，增添了操作办法，，，，，，在临床磨练中ABS-ELISA应用未几。。
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科研项目中检测微量的因素如细胞因子常接纳本法。。
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