卵白质免疫印迹实验

上海yl23455永利的生物部在体外生物学领域有富厚普遍的履历，，，
，，通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳固细胞株建设、基因敲除、RNAi和MicroRNA手艺等，，，
，，提供一套完整的生物学效劳。。。。。
。

在细胞生物学研究中，，，
，，有时要对细胞膜分子、胞内分子或表达产品举行定性或／和定量。。。。。
。但由于靶卵白表达水乎不太高，，，
，，用细胞裂解液或表达上清举行SDS-PAGE电泳、免疫印迹（Western blot）检测很难抵达实验目的。。。。。
。为此可用特异性识别靶卵白的抗体举行免疫沉淀，，，
，，纯化和富集靶抗原。。。。。
。免疫沉淀所获得的卵白可举行SDS－PAGE电泳，，，
，，经考马氏亮蓝染色或银染后视察目的卵白条带。。。。。
。若是免疫沉淀获得的目的卵白量低于考马氏亮蓝染色或银染的检测下限，，，
，，可接纳 Western blot检测要领，，，
，，提高检测的迅速度，，，
，，抵达实验目的。。。。。
。

免疫印迹(immunoblotting)又称卵白质印迹(westernblot)，，，
，，它是凭证抗原抗体的特异性连系检测重大样品中的某种卵白的要领。。。。。
。western blot是在凝胶电泳和固相免疫测定手艺基础上生长起来的一种新的免疫生化手艺。。。。。
。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高区分力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，，，
，，现已成为卵白剖析的一种通例手艺。。。。。
。免疫印迹常用于判断某种卵白，，，
，，并能对卵白举行定性和半定量剖析。。。。。
。

免疫印迹法分三个阶段举行。。。。。
。
第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等卵白样品经SDS处置惩罚后带阴电荷，，，
，，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，，，
，，分子量越。。。。。
。，，
，，泳动速率就越快。。。。。
。此阶段疏散效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。。。。。
。
第二阶段为电转移：将在凝胶中已经疏散的条带转移至硝酸纤维素膜上，，，
，，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），，，
，，通电45min转移即可完成。。。。。
。此阶段疏散的卵白质条带肉眼仍不可见。。。。。
。第三阶段为酶免疫定位：将印有卵白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，，，
，，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，，，
，，使区带染色。。。。。
。
 

一、卵白免疫实验原理 

印迹法：将生物大分子物质通过差别的途径转移到固相载体上，，，
，，转移后的固相载体经淬灭试剂处置惩罚后，，，
，，用适当的溶液漂洗，，，
，，置于含底物或探针的溶液中孵育，，，
，，可与关于的探针反应，，，
，，显出特异条带。。。。。
。
常见的印记法有Southern、Northern、Western印迹法，，，
，，划分用于检测DNA、RNA和卵白质。。。。。
。其中Western印记又称为免疫印迹。。。。。
。
其中，，，
，，免疫印迹的基来源理是将凝胶电泳与固相免疫相连系，，，
，，其主要的操作分为三个历程：
1)电泳：SDS-PAGE疏散各卵白组分；；；；；；
2)印记：将卵白质从凝胶转移到固相载体；；；；；；
3)免疫检测：依次与一级抗体和标记的二抗体反应，，，
，，通过底物或引发光引发显色，，，
，，视察目的条带的有无。。。。。
。

Western Blotting 是用来检测卵白质的一种手艺。。。。。
。
首先将含有待测卵白的卵白质混淆物举行凝胶电泳疏散，，，
，，然后将已经疏散的卵白质通过电泳手艺从凝胶转移到固体支持物上，，，
，，这一固体支持物现在常为硝酸纤维素薄膜。。。。。
。随后以待测卵白质上抗原决议簇特异性的抗体（称为第一抗体）为探针，，，
，，与固体支持物上的卵白质举行免疫反应，，，
，，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体举行免疫反应，，，
，，只有与第一抗体特异性连系的待测卵白才华与第二抗体爆发免疫反应。。。。。
。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂保存时就会泛起颜色反应，，，
，，连系有第一抗体、第二抗体的待测卵白，，，
，，通过颜色反应即能展现出来。。。。。
。
电泳将卵白质从凝胶转移到固体支持物上是通过电转移仪器完成的。。。。。
。它是将固体支持物面临阳极、凝胶面临阴极，，，
，，二者连系在一起，，，
，，然后将外面二侧用Whatman 3MM滤纸连系，，，
，，形成“三明治”结构，，，
，，放入电转移仪器上，，，
，，加入电泳缓冲液，，，
，，通上电源后，，，
，，卵白质即可从凝胶上转移到固体支持物上。。。。。
。

二、卵白免疫操作办法

1、卵白质电转移
戴上手套，，，
，，取下SDS-PAGE凝胶，，，
，，小心剥离凝胶。。。。。
。裁剪与凝胶同样大的硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，，，
，，在硝酸纤维素薄膜左下角剪去一角作为标记。。。。。
。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的外貌，，，
，，使水从膜的下部浸透以去除其间气泡，，，
，，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液中浸湿，，，
，，用蒸馏水淋洗石墨电极，，，
，，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，，，
，，在滤纸外貌转动玻璃棒以除去其间的气泡，，，
，，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小心平铺在滤纸上，，，
，，用玻璃棒小心去除气泡。。。。。
。随后将12%SDS-PAGE凝胶舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，，，
，，用玻璃棒小心去除气泡，，，
，，再将三层浸湿的滤纸平铺在凝胶上，，，
，，沁心去除气泡，，，
，，最后加上石墨电极板，，，
，，接通电源举行电转移，，，
，，电流的巨细由凝胶的巨细决议，，，
，，为0.65mA/平方厘米。。。。。
。电转移2小时后，，，
，，阻止通电，，，
，，卸掉电转移装置，，，
，，取下凝胶举行考马斯亮兰染色，，，
，，以检测电转移是否完全。。。。。
。小心取下硝酸纤维素薄膜，，，
，，放在一张干滤纸上，，，
，，吸干30-60分钟后，，，
，，最先进显色反应。。。。。
。
2、显色反应
首先举行分子量标记的氨基黑染色。。。。。
。切下转有分子量标记的硝酸纤维素薄膜，，，
，，用含有0.3%吐温20的PBS缓冲液漂洗三次后（每次15分钟），，，
，，再将其浸入氨基黑染液中，，，
，，室温染色5分钟，，，
，，然后置于氨基黑脱色液中脱去配景，，，
，，水中漂洗后景干备用。。。。。
。
转有样品的硝酸纤维素薄膜用含有5%脱脂牛奶的PBS缓冲液在室温下关闭2小时，，，
，，同时1：100加入兔抗GST第一抗体，，，
，，平缓摇动，，，
，，室温保温1小时。。。。。
。然后用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗4次，，，
，，每次  30分钟。。。。。
。将辣根过氧分物酶标记的羊抗兔免疫球卵白第二抗 体用关闭液稀释50倍后，，，
，，加入吐温20至终浓度为0.05%，，，
，，然后与上述漂洗的硝酸纤维素薄膜举行反应，，，
，，将膜浸于其中，，，
，，平放在平缓摇动的摇床平台上，，，
，，室温温育  1小时后，，，
，，用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗4次，，，
，，每次5分钟，，，
，，再加入4-氯萘酚显色液，，，
，，加入 5μ1 的30%H2O2，，，
，，将硝酸纤维素薄膜置于其中缓慢摇动，，，
，，待所检测的卵白带显色抵达最深水平后，，，
，，将硝酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中阻止显色反应。。。。。
。取出硝酸纤维素薄膜，，，
，，自然晾干后照相生涯效果。。。。。
。

三、免疫印迹手艺的注重事项

1、免疫印迹手艺所测定的只是目的卵白的相对含量。。。。。
。因此不可确定一种细胞含有几多目的卵白，，，
，，只能确定该卵白保存与否及其它条件下与其他细胞相比卵白的含量是高照旧低。。。。。
。
2、较量一种目的卵白在差别细胞或者统一细胞差别条件下的相对含量时，，，
，，各样平的总卵白量必需相等。。。。。
。
3、选用合适的 SDS-PAGE 胶浓度，，，
，，使目的卵白可以获得较好的区分。。。。。
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4、最先电泳和转移欠，，，
，，一定要确认电极的正负极讨论是否准确。。。。。
。
5、在免疫检测中，，，
，，要注重关闭非特异性连系位点。。。。。
。
6、抗体反应在封口塑料袋内举行，，，
，，一定要取出袋内的所有旗袍，，，
，，不然会导致抗体连系不匀称。。。。。
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7、操作要轻柔，，，
，，带手套，，，
，，不要再转移抹上造成任何刮痕。。。。。
。在整个操作中，，，
，，转移膜要始终在液体中，，，
，，不醒目燥。。。。。
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